单细胞测序揭示人肝细胞的异质性及肝前体细胞的存在

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撰文│刘薇 何志颖

编辑│陈圆圆  

审校│汤红明 

【据《Nature》2019 年7月报道】题：单细胞测序揭示人肝细胞的异质性及肝前体细胞的存在（作者Nadim Aizarani等）

肝脏作为处于中心地位的代谢协调器官，执行着多种功能，包括糖代谢、脂代谢、蛋白合成、胆汁合成等。同时，肝脏作为重要的实质性器官，又具有独特的组织再生功能。然而，目前在单细胞水平上对肝脏细胞组成结构的研究相对较少，这限制了我们对肝脏功能和疾病生物学分子机理的理解。

德国Max Planck免疫生物学和表观遗传学研究所Dominic Grün研究组与法国斯特拉斯堡大学Thomas F. Baumert研究团队合作，应用单细胞测序方法构建了高通量信息库，对人肝细胞进行分群分析，并对肝组织的细胞组成进行了深入探讨，首次绘制出完整的人类肝细胞图谱。

研究者选取来自9名供体的10372个肝细胞进行了单细胞测序，并对测序结果进行深入的信息学分析，构建了人类肝细胞单细胞测序数据库。对于测序结果的分析侧重于对所有肝细胞类型的定位及不同类型肝细胞的基因表达；同时，重点研究了上皮性肝前体细胞（实验方法和部分结果如图）。

图 单细胞测序技术揭示人肝脏细胞类型构成

A. 人肝细胞单细胞测序检测方法流程示意图 

B. 来自 9 个供体的正常肝组织的单细胞转录组的 t-SNE 图，展示肝细胞的主要分类 

C. 人类肝脏所有主要细胞群的亚型异质性

D. 显示每个细胞群的标记基因表达的热图

在此基础上，以正常肝细胞单细胞测序构建的高通量信息库为内参，对比分析了肝癌病人来源肝细胞的单细胞测序结果。揭示了肝癌特异性的细胞亚群，以及各亚群中的特异性基因表达。最后，以单细胞测序的方式比对了人原代肝细胞与从人肝细胞移植制备的人源化肝脏嵌合体小鼠经肝脏灌注分离的人肝细胞二者的基因表达差异。通过单细胞测序、测序信息分析及后续验证实验，得到如下结果：

首先，文章证明了人肝实质细胞可按基因表达状况分为若干个亚群，不同亚群的肝细胞呈现出空间分布上的不均一性：不同亚群肝细胞沿肝小叶的门静脉-中央静脉轴（portal–central axis of the liver lobule）分布，大致可分为近中央静脉区、近门静脉区以及位于二者之间的中间区域。在3395个表达基因当中，1384个基因（41%）表现出显著的区域分布特性。通过通路富集分析发现，近门静脉区的细胞模块富含参与生物氧化的基因（与在门静脉周围达到峰值的氧梯度浓度一致）；而中间区域的细胞模块富含细胞色素P450相关的异源物质代谢相关通路的基因。

其次，研究者对已知的以CD163⁺VSIG4⁺为标志的Kupffer细胞群进行了进一步的详细分析。分析结果显示，该群细胞根据各自表达的特有基因的不同，可以进一步划分为几个不同的亚群，各自执行不同的功能。

第三，鉴定出一群内皮来源的具有双向发育潜能的肝前体细胞。对以上皮细胞黏附分子EPCAM⁺ 为标志物分选出的肝细胞群进行单细胞测序，并对基因表达进行了深入的信息学分析后鉴定出一组和EPCAM表达相关的标志基因。EPCAM⁺细胞根据其各自基因表达进行亚群划分，可以将这一细胞群划分为以ASGR1⁺为标志的肝向细胞，以KRT19^highCFTR^highALB^low为标志的胆向细胞, 以及剩余的一群推测为新生肝前体细胞（同时具有肝向和胆向潜能）。

对EPCAM⁺的各细胞亚群分析发现，TROP2的表达水平与肝向分化负相关：在成熟胆管细胞中表达极高，在成熟肝细胞中表达极低。并推测TROP2中等表达（TROP2^int）的细胞亚群中包含有肝前体细胞——其基因表达呈现双向发育潜能：高表达胆管早期发育相关转录因子HES1，以及肝细胞早期发育中增殖和迁移相关的特异性标志物PROX1；低表达成熟肝细胞标志物如HNF4A， HP，ALB和成熟胆细胞标志物如KRT19和CFTR等。体外类器官实验证明了这一假设。

最后，将3个肝癌患者CD45⁺和CD45^-肝细胞进行单细胞测序，并同构建的人类肝细胞单细胞测序数据库进行比对。结果显示癌症细胞上调了WNT通路和Hedgehog信号通路；癌症细胞在基因表达上和EPCAM⁺的正常肝前体细胞很相似。

本文通过单细胞测序和生物信息学分析方法结合体内体外实验验证，构建了一个可信的人类肝脏单细胞测序数据库。该数据库的建立和应用，为肝脏相关疾病的分子机制探索提供了可靠背景，并对构建目前亟需的人类肝脏疾病模型做出了重大贡献。

（文章刊登于《医学参考报》干细胞与再生医学频道2019-05期第8版文章，ID：yxckbsc2019050801。图片来源于网络，如有侵权，请联系删除。）

原文：https://doi.org/10.1038/s41586-019-1373-2

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